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One Step RT-qPCR Probe Kit(一步法荧光定量反转录RT-qPCR Kit)

产品编号：P4305

产品规格：125T/250T

产品价格：950/1800

包装：包

储存条件：-20℃

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One Step RT-qPCR Probe Kit(一步法荧光定量反转录RT-qPCR Kit)

产品名称：

货号	产品名称	规格	目录价
P4305-125	One Step qRT-PCR Kit(一步法荧光定量反转录PCR Kit)	125T	950
P4305-250	One Step qRT-PCR Kit(一步法荧光定量反转录PCR Kit)	250T	1800

产品介绍：
本试剂本制品是采用SYBR Green I 嵌合荧光法进行Real Time PCR 的专用试剂，用本制品进行Real Time qRT-PCR 可在同一反应管内连续进行。反应过程中无需打开管盖添加试剂并可对扩增产物进行实时检测，避免了污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。非常适合于微量RNA 尤其是微量RNA病毒的检测。本试剂盒包括最佳配比优化的OneStep Enzyme Mix（包含突变改造TRUEscript M-MuLV H Minus逆转录酶、热启动HotMaster Taq DNA聚合酶和RNasin抑制剂mix），同时包含适用于逆转录和荧光PCR扩增的独特2 XqRT-PCR Mix反应体系。本酶M-MuLV(RNase Hˉ)的RNase H活性缺失，与M-MuLV 相比，具有更强的延伸能力和稳定性。同时该酶提高了耐热性，可以在42-50C反转录，提高了复杂二级结构，GC含量丰富模板反转录效率。而采用优质热启动酶HotMaster Taq DNA Polymerase可以最大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。

产品存储：－20℃ 保存，有效期6个月。

适用范围：
适用于高拷贝、低拷贝基因检测；部分高GC含量或具有复杂二级结构的RNA模板。

注意事项：
● 当同时需要进行数次Real Time One Step qRT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master Mix，其中包括RNase-free ddH2O、Buffer、各种酶等），然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。
● 使用TRUEscript Enzyme Mix时，分取之前要小心地瞬间离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有高浓度的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
● 2 XqRT-PCR Mix内含Sybr Green I，保存或配制One Step qRT-PCR反应液时应避免强光照射。
● 为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板。
● 不同的片段，所需最佳RNA模板用量不同，过多的RNA会抑制反应，建议根据反应调整模板用量。
● 只能使用特异性引物，不能使用Oligo(dT) 和Random Primer 进行反应。

建议反应体系（20 μl）：
注意：2 XqRT-PCR Mix使用前充分融解颠倒混匀（避免剧烈涡旋产生大量气泡）。短期频繁使用可放4C冰箱。
根据下表冰上配制反应液：

Components	Volume	Final Concentration
2×qRT-PCR Mix	10 μl	1 X
Forward Primer（10μm）	0.4 μl	0.2 μM
Reverse Primer（10μm）	0.4 μl	0.2 μM
TRUEscript Enzyme Mix	0.8 μl	-
RNA template	X μl	1 pg-1μg
RNase free H₂O to final volume	20 μl	Not applicable

注意：引物浓度请以终浓度0.2-0.6μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。如果同进行多个反应，先按比例配成混合液，振荡混匀后，按每管 20-Xμl (X为模板量)分装。

Real Time PCR扩增：
1. 将配制好的反应体系混匀、离心后。
2. 将PCR仪器预热到42C，将PCR管置于荧光定量PCR热循环仪中，按以下反应条件进行反应。
扩增程序：

	温度	时间	循环数
1	42°C	20-30分钟	1
2	94°C	2-3分钟	1
3	94°C	20 秒	35-40
	55-60°C	20 秒
	72°C	20秒
4	根据需要加入融链曲线分析

注意：如果所采用的荧光定量PCR仪器没有特殊的要求，建议采用上述图表显示的标准的三步法PCR反应程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化，例如采用两步法进行扩增可以减少非特异扩增，增强扩增的特异性。
3. 实验结果分析。反应结束后确认One Step qRT-PCR的扩增曲线和融解曲线，进行qRT-PCR定量时制作标准曲线等。

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